pcr技术退火温度高低怎么决定

4、 1、退火温度低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。 退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值(Tm值=4(G+C) +2(A+T))为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。 然后在此次实验基础上做出预估。 退火温度对PCR的特异性有较大影响。 2、延伸时间:1min/kb(10kb内)。

3、 退火温度越高,断开氢键的热能越大,引物与模板越不易结合,反之,退火温度越低,越容易形成氢键,进行退火。 所以当温度高时,只有碱基匹配程度高的,也就是模板与引物形成配对数越多的引物,才能结合到模板上,这样扩增出来的条带最少,甚至只有一条,也就是引物和目的序列的完美匹配, 因此特异性越高。

2、 或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。 这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

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